Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh trên tôm chính xác chỉ trong 1h

Thời gian gần đây, tình hình dịch bệnh trên tôm diễn biến ngày càng phức tạp gây thiệt hại về mặt kinh tế cho người nuôi. Ứng dụng kĩ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh tôm là phương pháp hữu hiệu cho kết quả và độ chính xác cao.

Vậy kỹ thuật PCR là gì?

Định nghĩa kỹ thuật PCR là gì từ lâu đã được người nuôi tôm biết đến, có thể hiểu đơn giản về kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.

Giải đáp kỹ thuật PCR là gì? Ứng dụng như thế nào trong chẩn đoán bệnh tôm?

Giải đáp kỹ thuật PCR là gì? Ứng dụng như thế nào trong chẩn đoán bệnh tôm?

Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:

Bước 1: Biến tính (denaturation): Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95oC) trong vòng 30 – 60 giây, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn. Hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.

Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization): Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là khoảng 55 – 65 oC. Tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. Đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR.

Bước 3Kéo dài (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC, để DNA polymerase hoạt động kéo dài mạch. Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào các primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Sự tổng hợp này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside triphosphate (dNTP).

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân lên thành 2 bản sao và nếu chu kỳ lặp đi lặp lại liên tục từ 30 đến 40 chu kỳ thì từ một DNA đích đã nhân bản thành 230 đến 240 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao.

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

1. DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.

2. Enzyme

Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nóng Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính. Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn.

4. Primer

Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR. Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn.

5. Các thành phần khác

— Nồng độ dNTP (deoxynucleotide triphotphat)

Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20 – 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.

— Nồng độ MgCl2

Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ là Co – factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp.

— Dung dịch đệm

Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với các đệm đang có mặt trên thị trường – 16,6 mM ammoniumsulfate – 67,7 mM TRIS – HCl, pH 8,89 – 10 mM beta – mercaptoethanol – 170 microgams/ml BSA – 1,5 – 3 mM MgCl2

Ứng dụng của PCR trong chẩn đoán bệnh trên tôm

Hiện nay, thành tựu của kỹ thuật PCR mở nhiều triển vọng cho ngành Sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y,…

Tôm là loài thủy sản hiện đang được nuôi nhiều trên diện tích rộng và mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu tương đối lớn cho ngành Thủy sản Việt Nam. Tuy nhiên, loài này dễ cảm nhiễm với bệnh do nhiều loại virus gây ra với cường độ cao. Tình hình dịch bệnh diễn biến ngày càng phức tạp. Cho đến nay, các phương pháp phòng và điều trị bệnh thông thường hiện đang được ứng dụng vẫn chưa mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh trên tôm là phương thức quản lý bệnh hiệu quả hơn.

Kĩ thuật PCR có thể chẩn đoán, phát hiện bệnh hoại tử gan tụy trên tôm

Kĩ thuật PCR có thể chẩn đoán, phát hiện bệnh hoại tử gan tụy trên tôm

Kỹ thuật PCR có thể chuẩn đoán hầu hết các bênh nguy hiểm gây hại trên tôm như:

— Bệnh đốm trắng trên tôm(WSSV)

Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (AHPND/EMS)

— Bệnh vi bào tử trùng trên tôm (EHP)

— Hội chứng Taura trên tôm (TSV)

— Bệnh đầu vàng trên tôm (YHV)

— Bệnh hoại tử cơ trên tôm (IMNV)

— Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV)

— Bệnh Phát sáng trên tôm (Vibrio harveyi)

— Vi khuẩn gây hoại tử gan tụy (NHPB),…

Dr.Tom giới thiệu cho người nuôi hệ thống Pockit được thiết kế linh hoạt, cho phép đồng thời có thể chẩn đoán được nhiều bệnh trong một lần chạy mẫu chỉ trong 1 giờ đồng hồ. Bộ 2 sản phẩm được Dr.Tom nhập khẩu trực tiếp bởi hãng GeneReach đảm bảo cho kết quả chính xác và nhanh chóng ngay tại ao nuôi mà không cần phải đến các phòng thí nghiệm truyền thống.

1. Máy PCR di động Pockit Xpress

— Máy được vận hành dựa trên kỹ thuật PCR hiện đại với đầu dò Taqman

— Hệ thống được thiết kế linh hoạt, một chương trình có thể ứng dụng cho tất cả các chỉ tiêu cho phép đồng thời chẩn đoán được nhiều bệnh

— Cơ chế tự phân tích và cho kết quả trên màn hình LCD

— Máy ứng dụng Chip DSP phân tích và lưu trữ kết quả trên máy tính

— Độ nhạy phản ứng với 10 copy/phản ứng

— Đo được 8 mẫu/ lần

— Cho kết quả chỉ trong 1h

Xem chi tiết sản phẩm => TẠI ĐÂY

2. Máy PCR cầm tay Pockit micro Plus

– Máy PCR cầm tay Pockit micro Plus sử dụng kỹ thuật PCR với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy cao và cho kết quả chính xác chỉ trong vòng 1h đồng hồ.

– Thiết kế máy nhỏ gọn có thể bỏ túi đem đi hiện trường một cách dễ dàng

– Màn hình hiện thị dễ đọc kết quả âm tính hoặc dương tính được hiện thị trực tiếp trên màn hình

– Độ nhạy 10 copy/phản ứng

– Đo 4 mẫu/lần

Xem chi tiết sản phẩm => TẠI ĐÂY

Hiện nay kỹ thuật PCR, kỹ thuật Real time PCR được ứng dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản. Dr.Tom khuyến khích người nuôi tìm hiểu kỹ thuật PCR là gì? Và ứng dụng vào chẩn đoán bệnh tôm hiệu quả để có biện pháp khắc phục dịch bệnh một cách triệt để.

XEM NGAY >> Một giải pháp tổng thể đối với EHP – Theo “A Solution – Giải pháp hàng đầu”

Tìm kiếm liên quan:

– Các bước tiến hành của kỹ thuật PCR

– Kỹ thuật PCR phần 2

– Kỹ thuật PCR Slide

– Giáo trình PCR

icon up top